就乾思生物科技列舉的五個(gè)必需：培養(yǎng)基、血清、無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境、恒定生長(zhǎng)溫度以及合適氣體的環(huán)境是非常重要的，必須要注意的地方。

前期需要做好準(zhǔn)備工作，包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔和消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試等。設(shè)施，器材就有超凈臺(tái)，倒置顯微鏡，離心機(jī)，壓力蒸汽消毒器等，以及各種的玻璃器材，塑料器材，橡皮器材和金屬器材。

具體步驟如下：

一、復(fù)蘇

1、把凍存管從液氮中取出來(lái)，立即投入37度水浴鍋中，輕微搖動(dòng)。液體都融化后（大概1-1.5分鐘），拿出來(lái)噴點(diǎn)酒精放在超凈工作臺(tái)里。

2、把上述細(xì)胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細(xì)胞都洗下來(lái)），1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。

2.把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細(xì)胞懸浮起來(lái)。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞均勻分布。

4.標(biāo)好細(xì)胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基。

5.zui后3天換一次培養(yǎng)基。

二、傳代（傳代動(dòng)物細(xì)胞）

1.培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%-90%時(shí)要傳代。

2.把原有培養(yǎng)基吸掉。

3.加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福芨采w細(xì)胞就行），消化1-2分鐘。

4.細(xì)胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化。

5.用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來(lái)。

6.把細(xì)胞吸到15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。

7.倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細(xì)胞都吹起來(lái)。

8.根據(jù)細(xì)胞種類把細(xì)胞傳到幾個(gè)培養(yǎng)皿中。一般，癌細(xì)胞分5個(gè)，正常細(xì)胞傳3個(gè)。繼續(xù)培養(yǎng)。

三、凍存

1、把細(xì)胞消化下來(lái)并離心（同上）。

2、用配好的凍存液把細(xì)胞懸浮起來(lái)，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘。

3、寫明細(xì)胞種類，凍存日期。（4℃--30min，-20℃--30min，-80℃。）

（凍存液的配制：70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。）

需要注意的事項(xiàng)：

實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，從活體分離材料后要低溫保存，并盡快進(jìn)行細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)。無(wú)菌操作。操作時(shí)用的培養(yǎng)液，可加平時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液五倍含量的請(qǐng)鏈霉素。

用酶法分離細(xì)胞時(shí)，注意酶液的濃度和控制消化時(shí)間。貼塊法分離細(xì)胞時(shí)，注意動(dòng)作要輕柔，不要傷到細(xì)胞組織，組織塊邊緣盡量平整有利于細(xì)胞游離。

培養(yǎng)液的選擇。不同的細(xì)胞有對(duì)培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)的要求不同，根據(jù)所分離細(xì)胞的特性選擇。

目前，細(xì)胞培養(yǎng)的目的和用途主要科學(xué)研究及生物制藥，它的耗資少、經(jīng)濟(jì)、成本低、可大量培養(yǎng)，利于生物制品的生產(chǎn)。所以希望未來(lái)，我們的生物科技越來(lái)越好，共同走向美好的明天！